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蛋白標記的主要目的是監(jiān)測生物過程、輔助檢測(例如化合物的可靠定量、蛋白質修飾的特異性檢測)或者純化標記后的蛋白及其結合對象。蛋白質的標記能夠提高檢測靈敏度以及簡化檢測工作流程。
目前有多種蛋白質標記技術來幫助我們研究感興趣的蛋白質的豐度、位置、相互作用、翻譯后修飾、功能,乃至監(jiān)測活細胞中的蛋白質運輸?shù)葐栴}。目前有多種類型的標記物和標記方式可供選擇,但是針對特定的應用應當選擇適合的標記策略。
熒光蛋白標記:
將目的蛋白與熒光蛋白融合,則能夠實現(xiàn)目的蛋白的細胞內觀察,可用于多色標記和熒光共振能量轉移(FRET)應用,用于可視化蛋白質與其他亞細胞結構的易位,研究蛋白質-蛋白質共定位,檢測來自不同啟動子的基因表達的開始,以及混合細胞群的分離。從早期的綠色熒光蛋白GFP發(fā)展到現(xiàn)在,我們已經擁有了覆蓋多種光譜區(qū)域的熒光蛋白,包括綠色熒光蛋白、藍色和藍綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、橙色熒光蛋白、紅色熒光蛋白,不同光譜型的熒光蛋白在亮度、光穩(wěn)定性、分子大小上有所不同。
熒光染料蛋白體外標記
熒光染料標記蛋白或多肽技術是常見的蛋白體外標記技術,除了GFP等融合表達熒光蛋白之外,目標蛋白經過熒光染料標記可以直接進行活體示蹤、細胞分選等下游實驗操作。
原理:熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物,受到紫外光或藍紫光照射時,可激發(fā)成為激發(fā)態(tài),當從激發(fā)態(tài)恢復基態(tài)時,發(fā)出熒光。蛋白熒光標記技術利用熒光物質共價結合在目標分子的某個基團上,利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。
應用和特點:活化的熒光染料,例如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(Rhodamine B)或Alexa Fluor染料等,可用于標記抗體或蛋白功能基團,生成分子探針并通過熒光成像進行檢測。當用熒光染料化學標記特異性抗體或其他純化的生物分子時,它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針,應用于細胞成像、流式細胞術、蛋白質印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。因為熒光標記物具有無放射物污染、操作簡便等優(yōu)點,使其在蛋白功能研究、藥物篩選等許多研究領域的應用日趨廣泛。
蛋白量子點標記
原理:量子點(Quantum Dots)是一種無機納米結晶體,它可以根據(jù)其大小發(fā)出特定波長的熒光,它具有非常高的消光系數(shù),其消光系數(shù)要比小分子熒光基團和熒光蛋白高出10~100倍,同時量子點的量子產率也很好。典型的量子點都含有一個CdSe或CdTe核心,外面包裹一硫化鋅(ZnS)外殼。量子點的吸收波長范圍覆蓋從非常短的波長至略低于其發(fā)射波長的廣闊范圍,因此一束單波長激發(fā)光就可以讓量子點達到多重發(fā)射。
應用和特點:目前研究出的水溶性量子點和油溶性量子點可以與抗體、鏈霉親和素等分子進行偶聯(lián),應用于生物標記檢測、高通量編碼、活體成像及動態(tài)示蹤等領域。不過結合了生物大分子的水溶性量子點體積較大(直徑約10 nm~30 nm),從而阻礙了它通過細胞膜結構,因此只能用于經過透化處理的細胞,或者只能對胞外蛋白或可以被細胞內吞的蛋白進行研究。
熒光標記蛋白:
熒光標記的anti-CD4蛋白
熒光標記血小板糖蛋白
熒光標記甘露糖 6-磷酸-人血清白蛋白(M6P-HSA)
熒光標記熱休克蛋白HSP27
熒光標記硒結合蛋白 1 SBP1
熒光標記鋅指蛋白160
熒光標記微管蛋白α6 α-tubulin
熒光標記微絲蛋白質粒
熒光標記微管骨架蛋白質粒
熒光標記重組靈芝免疫調節(jié)蛋白
熒光標記的GSTP1蛋白
熒光標記乳蛋白
熒光標記抗原蛋白
熒光標記納米顆粒包被哈氏弧菌抗原蛋白TssJ
熒光標記豬血源纖維蛋白
熒光標記自噬底物蛋白p62
熒光標記自噬特異性蛋白LC-3Ⅱ
熒光標記骨橋蛋白 OPN
熒光標記當歸蛋白(ASPR)
熒光標記內質網(wǎng)跨膜蛋白PERK
熒光標記力達霉素輔基蛋白
熒光標記LDM輔基蛋白
熒光標記自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ
熒光標記牛血纖維蛋白原
熒光標記hVDAC1重組蛋白
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