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內容提要

準確的術中組織識別是**手術的關鍵，但傳統方法費時費力，大大延遲了術中決策的時間。本文提出了一種基質金屬蛋白酶MMP14激活NIR-II納米探針(A&MMP@Ag₂S-AF7P)用于快速無擾動組織分析進行體外和體內神經母細胞瘤診斷。A&MMP@Ag₂S-AF7P在正常組織中熒光微弱，通過抑制神經母細胞瘤中過表達的MMP-14介導的Ag₂S量子點與A1094之間的熒光共振能量轉移(FRET)而迅速激活，膜穿透肽R9 (TAT 肽)可以使納米探針在癌細胞中有效內化，提供更高的**-正常(T/N)組織比。病變的即時判別和**邊緣的確認使納米探針成為適合癌癥手術或組織活檢程序的快速診斷試劑。

前言

手術切除是目前大多數實體瘤最主要和最有效的治療方法。術中冰凍切片組織病理學中的HE染色作為金標準，已成為手術中不可或缺的一部分，在很大程度上決定了進一步手術方案的方向。分子檢測技術為癌癥特異性生物標記物的臨床決策提供了巨大的前景，從而提高癌癥的檢測和診斷。其中，熒光分子成像具有實時、高靈敏度、高特異性、無電離輻射等特點，被認為是術中組織病理學診斷的優先選擇，特別是近紅外II熒光(NIR-II, 1000 – 1700 nm)成像技術顯著提高了組織穿透性、空間分辨率和可忽略的自體熒光，使疾病檢測具有更高的精度和靈敏度。兒童神經母細胞瘤(Children neuroblastoma, NB)是兒童最常見的顱外實體瘤，在手術過程中如何快速判斷組織的惡性和良性仍然是一個挑戰。MMP14是一種細胞膜錨定酶，在兒童神經母細胞瘤中過度表達。因此，結合NIR-II熒光成像的獨特光學特性和MMP14生物標志物的高度特異性的優勢，有望提供一種快速、準確的診斷方法，協助術中決策。作者開發了一種可激活的NIR-II熒光納米探A&MMP@Ag₂S-AF7P快速術中病理診斷NB。AF7P是一種靶向MMP14膜型(MT)環結構域的親和肽，作為NB的靶向配體; MMP14活化肽(MMP)通過靜電相互作用將聚陽離子型細胞穿透肽R9 (TAT-peptide)和聚陰離子型細胞穿透肽直接組裝在納米探針表面片段(E8)；由NIR-II發射的Ag₂S量子點和NIR吸收體A1094組成的FRET系統可以有效阻斷熒光發射。這種納米探針可應用于臨床標本的快速染色或噴涂，還可以通過局部給藥在體內檢測**。病變的即時確認和**邊緣的明確使納米探針足夠作為新的診斷試劑納入癌癥手術或組織活檢程序。

圖1。A) A&MMP@Ag₂S-AF7P檢測NB示意圖。B) A&MMP@Ag₂S-AF7P的TEM。C) 各種納米顆粒的水動力直徑。D) Ag₂S、Ag₂S- AF7P和A&MMP@Ag₂S-AF7P的吸光度和熒光光譜。

靶向可激活納米探針A&MMP@Ag₂S-AF7P的制備主要包括三個步驟，分別是Ag₂S量子點的合成、MMP 14活性肽的制備(MMP@Ag₂S-AF7P)、A&MMP@Ag₂S-AF7P的構建。A&MMP@Ag₂S-AF7P的TEM如圖1b所示，在水溶液中表現出良好的分散性，平均粒徑為160 nm。如圖1 C所示，經過后續的表面改性，各種納米顆粒的水動力直徑從80 nm到270 nm。Zeta電位測量結果顯示，Ag₂S、Ag₂S-AF7P、MMP@Ag₂S-AF7P和A&MMP@Ag₂S-AF7P的表面電荷存在明顯差異。該納米探針在1094 nm處表現出強烈的吸收，由于有效的FRET效應，NIR-II窗口的熒光信號很弱。當A1094/Ag₂S的摩爾比為120:1時，淬火效率達到78%(圖1 D)。

本研究的癌細胞檢測原理是基于MMP14介導的熒光激活。高效和特異的酶活性被認為是A&MMP@Ag₂S-AF7P實現快速檢測癌細胞的必要條件。作者通過記錄A&MMP@Ag₂S-AF7P在生理-上對各種主要生理離子和分子的反應來檢測其選擇性。如圖2所示，在A&MMP@Ag₂S-AF7P溶液中加入特定的MMP14酶，激發了納米探針的快速熒光恢復，熒光強度的定量分析顯示增強了近5倍。MMP14的酶活性受到其抑制劑GM6001的抑制，納米探針的熒光回收率明顯受到抑制(圖2B)。這些數據都表明A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針對MMP14的高特異性。采用實時熒光光譜分析方法監測了MMP14活化A&MMP@Ag₂S-AF7P熒光的動態過程。加入MMP14后，觀察到NIR- II熒光信號穩定增加，同時近紅外吸收體A1094快速釋放(圖2C，D)。96%的納米探針可在45 min內發光，表明其快速高效的酶響應。沒有MMP14的對照組表現出較弱的NIR-II熒光信號。以上結果表明，A&MMP@Ag₂S-AF7P可被MMP14快速而特異地激活。

圖2。A) A&MMP@Ag₂S-AF7P對不同分析物的選擇性; B) Ag₂S QDs在(A) 1050 nm范圍內的熒光強度。C) 酶介導的熒光恢復和D) A1094釋放動力學。

為了檢驗A&MMP@Ag₂S-AF7P快速術中組織學診斷的能力，作者測試了納米探針的性能，以分析從動物模型和臨床標本中獲得的組織樣本(圖3a)。首先，從KP-N-NS荷瘤小鼠中切除的新鮮**組織切成1 mm厚，使用A&MMP@Ag₂S-AF7P通過簡單的一步染色進行組織分析。30分鐘后，寬帶多路顯微鏡熒光顯微成像顯示組織的某些區域有強烈的NIR-II熒光信號，如圖3 B所示，與DAPI細胞核染色很好地匹配。隨后，對同樣的**組織進行標準HE染色，**區域的精確共定位證實了A&MMP@Ag₂S-AF7P對**的精確檢測能力(圖3 B)，驗證了A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針在精確識別臨床**組織方面的潛力。如圖3 C、D所示，將NB患者的**組織與A&MMP@Ag₂S-AF7P孵育30分鐘，并進一步用DAPI染色。在**組織和轉移組織中可見明顯的NIR-II熒光強度。MMP14抑制劑(GM6001)預孵育的**組織的熒光強度明顯弱于未孵育的**組織。由于T/N高于正常的組織比(T/N=7.6)，可以清楚地識別出**邊緣，因此A&MMP@Ag₂S-AF7P只能在**組織中被精確激活。臨床免疫組化(IHC)結果進一步表明A&MMP@Ag₂S-AF7P對NB**細胞具有較高的特異性。

圖3。A) 術中組織快速病理檢查示意圖。B) KP-N-NS荷瘤小鼠**組織切除后的熒光顯微鏡圖像及相應的HE染色。C, D) MMP抑制劑GM6001治療的患者切除的**結節的NIR-II熒光和明亮視野圖像。T=**組織，N=正常組織。

作者通過腹腔接種過表達MMP14的人腎上腺NB細胞KP-N-NS來檢測腹腔轉移模型中體內術中診斷的可行性。在成功地將制備好的A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針腹腔注射到小鼠體內，劑量為2.5 mg×kg^-1，采用NIR-II成像系統進行體內熒光成像。最初，在小鼠的腹部觀察到無法檢測到的熒光。然后，荷瘤小鼠腹腔多個部位被NIR-II熒光點亮(圖4a)，熒光斑數量在45min內保持相對穩定，T/N比高。在NIR-II熒光成像的引導下，將這些斑點從小鼠體內去除，同時以裸眼手術作為對照(每組5只)(圖4 B)。然后收集NIR-II熒光成像引導下和未引導下切除的結節，并進行HE染色分析。結果A&MMP@Ag₂S-AF7P引導手術共切除44個結節，陽性率84%，明顯優于裸眼手術(62%)共切除33個結節(圖4C)。由于這種靶標可激活的NIR-II熒光成像策略的高靈敏度和特異性，在NIRII熒光成像的指導下，可清晰識別125mm以下的**結節大小(圖4d)。**響應性A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針具有優越的T/N信號比和高靈敏度，能夠檢測微小的不可見病變，有助于在未來的臨床實踐中更高效、準確的手術。

圖4。A) IP給藥A&MMP@Ag₂S-AF7P后腹膜**模型術前、術后NIR-II和明亮視野(BF)圖像。B)切除**結節的NIR-II熒光和BF圖像。比例尺= 5 mm。C)有無NIR-II熒光成像引導下**結節陽性率直方圖。D) NIR-II引導下和未引導下切除的單個**直徑點圖。

由于NB起源于神經嵴的胚胎交感腎上腺譜系，通常發生于腹部或腎上腺髓質，作者采用瘤周組織中存在的主要細胞類型來檢測A&MMP@Ag₂S-AF7P的細胞攝取。A&MMP@Ag₂S-AF7P濃度為30 mg×m L^-1分別在37°C下保溫2小時。上述細胞對A&MMP@Ag₂S-AF7P的熒光激活影響很小，而NB KP-N-NS細胞可以很快被照亮，這意味著A&MMP@Ag₂S-AF7P對MMP14具有高特異性(圖5)。因此，進一步證明了我們的納米探針對過表達的MMP14酶具有高度特異性的識別和激活NB，確保了其對NB的準確和靈敏診斷。為了驗證A&MMP@Ag₂S-AF7P的生物安全性，作者進行了一系列的體外和體內研究。MTT實驗和流式細胞術分析表明，有聽不清細胞毒性KP-N-NS細胞和L929細胞與A&MMP@Ag₂S-AF7P孵化后24 h A&MMP@Ag₂SAF7P的濃度的增加(從0到160 mg×mL^-1),發生凋亡和壞死的KP-N-NS細胞和L929細胞數量與未加A&MMP@Ag₂S-AF7P處理的對照組相比差異無統計學意義。Balb/c小鼠在第1天和第7天，經IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag₂S-AF7P后，血液學評估和血液生化分析進一步揭示了A&MMP@Ag₂S-AF7P對治療小鼠的毒性作用。與對照組相比，注射后1天和7天的血液學和生化指標均無統計學差異。作者還獲得了Balb/c小鼠IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag₂S-AF7P，提示無炎癥細胞或細胞壞死。基于以上結果，在成像濃度下，A&MMP@Ag₂S-AF7P對小鼠的毒性可以忽略。

圖5。顯微鏡熒光圖像顯示MMP14陽性的KP-NNS與A&MMP@Ag₂S-AF7P處理后的腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞和脾細胞。比例尺= 50 mm。

結論

作者成功地開發了一種**特異性酶激活NIR-II納米探針，用于快速無擾動組織分析，用于離體和體內NB診斷。A&MMP@Ag₂S-AF7P既包含MMP14靶向肽AF7P，又包含其在聚陽離子細胞穿透肽(R9)和聚陰離子片段(E8)之間的可剪切連接子。Ag₂S量子點的NIR-II熒光通過過表達MMP14特異性識別NB細胞后，由于FRET的破壞而迅速激活，同時膜穿透肽R9暴露導致納米探針在NB細胞內高效內化。獨家NB細胞染色，染色時間很短，沒有組織固定和冷凍切片，分子水平的精確診斷，以及良好的生物相容性，使a&MMP@Ag2S-AF7P納米探針足夠作為快速診斷試劑納入癌癥手術或組織活檢程序。該策略可擴展到其他**，實現術中檢測和精確手術，具有很大的臨床應用潛力。

參考文獻

Rapid Unperturbed-Tissue Analysis for Intraoperative Cancer Diagnosis Using an Enzyme-Activated NIR-II Nanoprobe, Yang Zhan, Sisi Ling, Haoying Huang, Yejun Zhang, Guangcun Chen, Shungen Huang, Chunyan Li,* Wanliang Guo,* Qiangbin Wang*, Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2637 –2642. DOI: 10.1002/anie.202011903.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202011903

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