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NH2-PEG-NH2雙氨基聚乙二醇的制備具體步驟和表征

　聚乙二醇[po ly(ethylene glyco l) , PEG ]具有良好的生物、血液相容性[ 1, 2 ]和親水性, 無免疫原性, 常用來修飾蛋白質、多肽、酶等生化藥物[ 3～ 5 ]和生物醫用材料[ 6 ]。由于通過環氧乙烷或乙二醇聚合得到的PEG 端基是反應活性較低的羥基, 只能在較激烈的條件下與其它基團發生反應, 易破壞被修飾物, 實際應用時常需先進行活化。PEG 傳統活化方法有酯化法[ 7 ]、氰脲酰氯法[ 8 ]等。本文采用對甲苯磺酸酯法進行活化, 制得分子量為4000 和10000 的雙端氨基聚乙二醇(A T 2PEG, 1) , 產率和轉化率高, 除端基發生改變外, 不會在PEG 分子鏈上引入其它基團, 避免影響被修飾物的活性。

NH2-PEG-OH

NH2-PEG-Hydrazide

NH2-PEG-Silane

NH2-peg-Acrylates

NH2-peg-Lipoic acid

NH2-peg-Acetylthio

NH2-PEG-Nitrophenyl Carbonates (NPC)

NH2-PEG-ValericAcids

NH2-PEG-Acrylamide

NH2-PEG-Bromide(Br)

NH2-PEG-Vinylsulfone(VS)

NH2-PEG-Methacrylate(MA)

NH2-PEG-Iodoacetate(IA)

NH2-PEG-Chloride

DBCO-PEG-NH2

TCO-PEG-NH2

Tetrazine-PEG-NH2

NH2-PEG-Folate

NH2-PEG-CHEMS

1　材料和方法

1. 1　儀器與材料

V arian INOVA 500 型核磁共振儀, 溶劑CDCl3, 內標TM S, 測試溫度26. 0℃; V ario EL 型元素分析儀( 德國Elementar公司)。對甲苯磺酰氯[T sCl, 廣州化學試劑廠, 化學純, 用苯2石油 (60～ 90℃) (1∶20, v?v ) 重結晶1 次, 真空40℃烘干1 d ]; PEG (廣州化學玻璃試劑公司, 數均分子量分別為4000和10000, 于120℃減壓攪拌4 h)。

1. 2　合成方法

PEG 的轉氨反應見圖1。取PEG 4 K (20g,5 mmo l) 溶于CH2Cl2 (100m l) , 加入T sCl (3. 81g,20 mmo l) 的吡啶(76 m l) 溶液, 充分混合, 室溫反應24 h, 用3 mo l?L HCl (470 m l) 萃取, 有機層加入碳酸氫鈉(5 g) 劇烈攪拌, 過濾, 濾液蒸干得白色粉末狀PEG2對甲苯磺酸酯(2) 粗品(17. 42 g, 87% )。

40℃攪拌下將2 粗品溶于THF (8. 7m l) , 將其逐滴滴至劇烈攪拌的乙醚(435m l) 中, 析出沉淀后過濾,真空干燥得2 純品(16. 01 g) , 連同25%～ 28% 氨水(160 m l) 置250 m l 耐壓容器中, 于140℃密閉反應6 h 后冷至室溫, 用CH2Cl2 (160 m l) 萃取, 向有機層[ 約140 m l, 含PEG2對甲苯磺酸銨鹽(3) ] 中加入1 mo l?LNaOH 水溶液(140 m l) ,攪拌2 h 后靜置,

分出有機層, 水洗至中性, 蒸干后即得A T 2PEG4K12. 25 g。同法進行PEG 10 K 的轉氨反應。采用酸堿滴定法測定PEG 的端羥基濃度和1的端氨基濃度[ 8 ]。分別取PEG、2、3 及1, 用適量THF 溶解, 加入乙醚后析出沉淀, 過濾后于30℃真空干燥。如此重復3 次, 得到的樣品進行1HNMR 檢測和元素分析, 計算氨基的摩爾數及羥基轉為氨基的反應轉化率。

Boc-NH-PEG-NH2

Boc-NH-PEG-COOH

Boc-NH-PEG-MAL

Boc-NH-PEG-NHS

Boc-NH-PEG-N3

Boc-NH-PEG-Alkyne

Boc-NH-PEG-SH

Boc-NH-PEG-Biotin

Boc-NH-PEG-CHO

Boc-NH-PEG-OPSS

Boc-NH-PEG-Hydrazide

Boc-NH-peg-silane

Boc-NH-peg-Acrylates

Boc-NH-peg-Lipoicacid

Boc-NH-peg-Tosylate

Boc-NH-peg-Acetylthio

Boc-NH-PEG-Aminooxy

Boc-NH-PEG-NitrophenylCarbonates (NPC)

Boc-NH-PEG-SAS

Boc-NH-PEG-SC

Boc-NH-PEG-SCM

Boc-NH-PEG-SG

Boc-NHPEG-SS

Boc-NH-PEG-SVA

Boc-NH-PEG-Epoxides

Boc-NH-PEG-ValericAcids

Boc-NH-PEG-Acrylamide

Boc-NH-PEG-Bromide(Br)

Boc-NH-PEG-Vinylsulfone(VS)

Boc-NH-PEG-Methacrylate(MA)

2　結果與討論

2. 1PEG 酯化反應

2 的1HNMR 譜(圖2) 中出現了苯環的芳香質子(D7. 15, d, 甲基鄰位的芳香質子; D 7. 34, d, 甲基間位的芳香質子) ; D 7. 80, d, 可能是雜質鋒; D2. 45 為甲基單峰; 重復單元- CH2 -CH2 - O - 的亞甲基質子(D 3.65,m ) ; 生成的新鍵(- CH2-CH2 - O TS) 中與硫酸酯基相連的亞甲基質子(D4.15, t) 等特征吸收峰, 說明PEG 的端羥基確實發生了對甲苯磺酸酯化反應。

2. 23 的生成

2 與氨水反應不同時間后所得產物的元素分析結果見圖3。由圖3 可見, 6 h 后氨基轉化率基本不變。高溫高壓下, 2 極易和氨水反應生成3, 隨著溫度上升, 反應速率增加, 但對耐壓容器的要求也提高。為得到較高的反應速率和轉化率又不致使成本過高,本實驗選擇反應溫度為140℃, 反應時間為6 h。

2. 31 的合成

3 經N aOH 堿洗生成氨基游離的1。反應液用大量水洗至中性。A T 2PEG4K 的1HNMR 譜見圖4。

圖4AT-PEG4K 的1HNMR 圖譜

除D 3. 65 處仍保留- CH2 - CH2 - O - 中的亞甲基質子峰外, 在D 3. 17 和D 3. 48 處分別出現了生成的新鍵(NH2- CH2 - CH2 - O - ) 中與端氨基相連的亞甲基質子峰及與氧相連的亞甲基質子峰。酸堿滴定及元素分析法測得不同分子量PEG的端羥基濃度、活化后端氨基濃度及轉化率見表1。對甲苯磺酸酯法活化PEG 后, 端氨基的轉化率均較高, 當PEG 的分子量為4000 時, 甚至可達92. 8%(元素分析法)。PEG4K 比PEG10K 的端羥基轉化率高, 可能的原因是: 分子量小的聚合物更易溶解,

Fmoc-NH-PEG-COOH

Fmoc-NH-PEG-MAL

Fmoc-NH-PEG-NHS

Fmoc-NH-PEG-N3

Fmoc-NH-PEG-Alkyne

Fmoc-NH-PEG-SH

Fmoc-NH-PEG-Biotin

Fmoc-NH-PEG-CHO

Fmoc-NH-PEG-OPSS

Fmoc-NH-PEG-Hydrazide

Fmoc-NH-peg-silane

Fmoc-NH-peg-Acrylates

Fmoc-NH-peg-Lipoicacid

Fmoc-NH-peg-Tosylate

Fmoc-NH-peg-Acetylthio

Fmoc-NH-PEG-Aminooxy

Fmoc-NH-PEG-NitrophenylCarbonates (NPC)

Fmoc-NH-PEG-SAS

Fmoc-NH-PEG-SC

Fmoc-NH-PEG-SCM

Fmoc-NH-PEG-SG

Fmoc-NHPEG-SS

Fmoc-NH-PEG-SVA

Fmoc-NH-PEG-Epoxides

Fmoc-NH-PEG-ValericAcids

Fmoc-NH-PEG-Acrylamide

Fmoc-NH-PEG-Bromide(Br)

其分子鏈在溶劑中完全舒展開,端羥基都暴露在外;分子量大的PEG 則可能因為分子間的相互作用力太大而使鏈相互纏繞成線團狀, 端羥基有可能被包埋起來, 減少了參與反應的幾率; 另外, 分子量越大,空間位阻越大, T sCl 越難接近分子鏈上的端羥基,即分子量增加后, 官能團之間的碰撞反應幾率降低,因此反應轉化率降低。另外從表中還可以看出, 元素分析法得到的反應轉化率比酸堿滴定法得到的大得多。導致差異的可能原因是:① 酸堿滴定測大分子物質端氨基時,目測終點判斷較困難, 導致測得的端氨基濃度偏低;② 酸堿法測得的端羥基濃度偏高; ③ 計算轉化率時, 元素分析以[ - OH ]理論值為基數, 酸堿滴定以[ - OH ]實測值為基數。