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使用BDP 581/591染料通過流式細胞術(shù)對活細胞進行實驗的一般建議：

以下建議是根據(jù)NS0細胞的實驗結(jié)果制定的。建議為細胞類型和當前任務(wù)確定染料，ROS誘導(dǎo)劑，抗氧化劑和實驗條件的最佳濃度。

1.可以使用懸浮液和貼壁細胞培養(yǎng)物。細胞應(yīng)在完整的培養(yǎng)基中生長，但與染料，ROS誘導(dǎo)劑和PBS中的抗氧化劑一起孵育。

2. 強烈建議包括陽性和陰性對照

? TBHP*（過氧化氫叔丁酯，ROS誘導(dǎo)劑）可用作陽性對照。

? 用抗氧化劑（α生育酚或丁基化羥基甲苯**）預(yù)處理的細胞在用TBHP處理后可用作陰性對照。

3. 用于ROS檢測的BDP 581/591染料的推薦終濃度為5μM或更高。

4. 孵育 30 分鐘足以用 BDP581/591 染料染色。

5. 在FL1通道中測量熒光（使用530/30 BP濾光片）

*或者，過氧化氫（H2O2） 可以使用。

**不推薦將NAC（N-乙酰基-L-半胱氨酸）作為抗氧化劑，因為它在BDP581/591染料的幾個系列實驗中沒有顯示出抗氧化作用。

使用 BDP 581/591 染料進行 ROS 檢測的應(yīng)用實例

該實驗是在NS0細胞上進行的。NS0懸浮培養(yǎng)是一種源自小鼠骨髓瘤的模型細胞系，用于生物醫(yī)學(xué)研究。細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

? ROS 誘導(dǎo)劑：TBHP（過氧化氫叔丁酯）

? 抗氧化劑：α-生育酚、丁基化羥基甲苯

? 檢測：BDP 581/591 羧酸，CellROX 橙色試劑（用于比較目的）

通過將α-生育酚（3.2mg）溶解在96%（0.5mL）乙醇中來制備α-生育酚（15mM）的溶液。

通過將丁基化羥基甲苯（900μg）溶解在96%（1mL）乙醇中來制備丁基化羥基甲苯（4mM）的溶液。

通過將BDP 581/591羧酸（40mg）溶解在DMSO（1 mL）中來制備BDP 581/591羧酸（100 mM）的溶液。從該儲備溶液中，取出體積為2.5μL的樣品，并在去離子無菌水（1mL）中稀釋，以制備濃度為250μM的溶液。

1.通過離心（800g持續(xù)8分鐘）收集細胞，重懸于預(yù)熱的PBS（0.5mL）中并分成樣品（每個樣品30萬個細胞）。

2.制備了以下樣品：

?抗氧化劑#1：將α生育酚（5μL，15mM）加入樣品（細胞懸浮液，30萬個細胞）（最終濃度150μM）。

?抗氧化劑#2：將丁基化的羥基甲苯（1μL，4mM）加入樣品（細胞懸浮液，30萬個細胞）（最終濃度8μM）。

將細胞與抗氧化劑在+37oС下孵育1小時。接下來加入TBHP（2μL，50mM）（最終濃度200μM），并將樣品在+37oС下孵育30分鐘。

?ROS誘導(dǎo)劑：加入TBHP（2μL，50mM）（最終濃度為200μM），并將樣品在+37oС下孵育30分鐘。

3. 樣品用熒光團處理：

?將BDP 581/591羧酸（10μL，250μM）加入樣品中（最終濃度為5μM）。

?將CellROX橙色試劑（1μL，250μM）加入到樣品中（新鮮溶液，最終濃度為500nM）。

4. 將所有樣品在+37oС下孵育30分鐘。

5. 流式細胞術(shù)使用BD FACSCalibur（BD Biosciences）分析儀進行。使用以下帶通（BP）濾光片配置的對數(shù)擴增標度：488 nm激發(fā)線，FL1（530/30 BP用于收集BDP 581/591熒光信號）和FL2（585/42 BP用于收集CellROX橙色熒光信號）。典型的運行使用具有約10，000個細胞的樣品。

將細胞置于正向（FS）和側(cè)散射（SS）點圖上，隨后分析BDP 581/591試劑和CellROX橙試劑的中位熒光強度。

BDP 581/591其他衍生物：

BODIPY 581/591-alkyne氟化硼二吡咯581/591炔烴

BODIPY 581/591-amine氟化硼二吡咯581/591-氨基

BODIPY 581/591-carboxylic acid氟化硼二吡咯581/591-羧基

BODIPY 581/591-NHS ester氟化硼二吡咯581/591-NHS ester

BODIPY 581/591-azide氟化硼二吡咯581/591-疊氮

BODIPY 581/591-hydrazide氟化硼二吡咯581/591-酰脛

BODIPY 581/591-maleimide氟化硼二吡咯581/591-馬來酰亞胺

BODIPY 581/591-tetrazine氟化硼二吡咯581/591-四嗪

BODIPY 581/591-DBCO氟化硼二吡咯581/591-DBCO

BODIPY偶聯(lián)物：

氟化聚多肽納米顆粒負載光敏劑(BODIPY-2Br)

三苯基膦(TPP)負載碘化光敏劑(BDPI)納米顆粒(PBDPI-TPP)

1,3,5,7-四甲基-4-苯基-(4-碘乙配胺)-BODIPY(TMPAB-I)

3，5-二芳基乙烯共軛BODIPY染料

3，5二苯乙烯基BODIPY染料

炔基修飾BODIPY染料

呋喃偶聯(lián)BODIPY染料

噻吩偶聯(lián)BODIPY并環(huán)產(chǎn)物染料

蒽基修飾BODIPY染料

寡聚噻吩修飾BODIPY染料

aza-BODIPY-Br2

噻吩并環(huán)BODIPY熒光染料

芳香醛修飾BODIPY染料

吡啶修飾Aza-BODIPY染料

8-羥基喹啉基團修飾BODIPY染料熒光探針

烷基胺修飾BODIPY染料

二苯乙烯基 BODIPY 衍生物

寡核苷酸（乙二醇）醚基修飾BODIPY染料

熒光分子探針TEG-DMA-Aza-BODIPY

熒光探針DCMA-Aza-BODIPY

熒光探針BODIPY-diONs

硫醇熒光探針Cz-BODIPY NBD

NBD熒光團修飾氮雜BODIPY