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瑞禧定制-細(xì)胞膜綠色熒光探針的制備

時(shí)間:2022-08-12 16:17:50       瀏覽:290

DiO是一種親脂性的熒光染料,可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞膜后,DiO在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散,最佳濃度時(shí)可以使整個(gè)細(xì)胞膜染色。DiO在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱,當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng),DiO被激發(fā)后可以發(fā)出綠色的熒光,具有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。可以用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC濾光片檢測。


DiO通常不會明顯影響細(xì)胞的生存力(viability),因此被廣泛用于正向或逆向的,活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-term tracer)。除了最簡單的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記外,還可以用于檢測細(xì)胞的融合和粘附,檢測發(fā)育或移植過程中細(xì)胞遷移,通過FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散,標(biāo)記脂蛋白等。下面和瑞禧生物小編一起來看看一種細(xì)胞膜綠色熒光探針的操作步驟:

染色液制備:

配置DMSOEtOH 儲存液:儲存液用 DMSOEtOH配置濃度15 mM

注意:未使用的儲存液保存在-20℃,分裝保存,避免反復(fù)凍融。

工作液制備:用合適的緩沖液(如:無血清培養(yǎng)基,HBSSPBS)稀釋儲存液,配制濃度為15 μM的工作液。

注意:工作液最終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來配制。可從推薦濃度的十倍以上找最佳條件。

懸浮細(xì)胞染色:

懸浮細(xì)胞密度為 1 × 106/mL加入到工作液中。

37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 220分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。

染色細(xì)胞試管在10001500轉(zhuǎn)離心5分鐘。

傾倒上清液,再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。

粘壁細(xì)胞的染色:

使粘壁的細(xì)胞在無菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

從培養(yǎng)基中移走蓋玻片,吸走過量培養(yǎng)液,將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。

在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液,輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。

37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 220分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。

吸干染料工作液,用培養(yǎng)液洗蓋玻片23次,每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞,培養(yǎng)510分鐘,然后吸干培養(yǎng)基。

顯微鏡檢測

DiDDiODiIDiRDiS濾光器的選擇

多色染料的同時(shí)檢測,濾光器按照以下設(shè)定: 

a) DiIDiOOmega XF52Chroma 51004

b) DiIDiDOmega XF92Chroma 51007

c) DiIDiODiDOmega XF93Chroma 61005

流式細(xì)胞儀檢測:

染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1FL2FL3FL4流式細(xì)胞儀檢測。

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